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[摘要] 目的 探讨芹菜素对食管鳞状细胞癌TE-1细胞顺铂敏感性的影响及机制。 方法 通过CCK-8实验检测芹菜素对TE-1细胞的抑制作用，再通过CCK-8实验和平板克隆实验检测TE-1细胞在芹菜素作用下对顺铂敏感性的改变，最后通过Western blot和Hoechst 33258核染色等实验检测芹菜素导致TE-1细胞对顺铂敏感性发生变化的具体机制。 结果 芹菜素显著地抑制了食管鳞状细胞癌TE-1细胞的生长，且这一作用具有浓度依赖性；CCK-8实验和平板克隆实验结果显示联合芹菜素可增强TE-1细胞对顺铂的敏感性，且这一作用具有浓度依赖性；芹菜素可以增加TE-1细胞在顺铂作用下的凋亡，减少内源性GRP78蛋白的表达。 结论 芹菜素可以增加TE-1细胞对顺铂的敏感性，可能成为一种新的食管鳞状细胞癌化疗辅助用药。
[关键词] 芹菜素；食管鳞状细胞癌；顺铂；敏感性
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）01（b）-0012-04
[Abstract] Objective To investigate the effects of Apigenin on Cisplatin sensitivity of esophageal squamous cell carcinoma TE-1 cells and its mechanisms. Methods Firstly， inhibition effect of Apigenin on TE-1 cells was tested using CCK-8 assay. Secondly， while combined with Apigenin， Cisplatin sensitivity change of TE-1 cells was detected by CCK-8 assay and colony formation assay. Finally， Western blot and Hoechst 33258 nuclear staining assays were used to investigate the mechanisms of Apigenin-induced Cisplatin sensitivity changes of TE-1 cells. Results Firstly， it demonstrated that Apigenin induced cytotoxic effect on esophageal squamous cell carcinoma TE-1 cells in a dose-dependent manner. Secondly， CCK-8 assay and colony formation assay also indicated that the Cisplatin sensitivity of TE-1 cells was increased by Apigenin in a dose-dependent manner. In addition， treatment of TE-1 cells with Apigenin displayed significant Cisplatin-induced apoptosis and reducted of endogenous GRP78 expression. Conclusion Apigenin can increase Cisplatin sensitivity of TE-1 cells and it is a promising adjuvant drug in the chemotherapy in esophageal squamous cell carcinoma.
[Key words] Apigenin； Esophageal squamous cell carcinoma； Cisplatin； Sensitivity
食管癌是世界排名第6位的致死性肿瘤[1]，在我国则表现为第4位致死性的肿瘤，在高发的省份如河南、河北和四川，其致死性居肿瘤第1位[2]。食管癌主要包括食管鳞状细胞癌（以下简称“食管鳞癌”）和食管腺癌两大类型，在我国食管癌病例中90%为食管鳞癌[3]。相当多的食管癌患者在确诊时已经无法单纯通过外科手术根治，即使术前予以新辅助化疗，联合手术治疗的预后仍不佳，5年存活率仅为20%[4]。因此，如何提高食管癌放化疗有效性成为近年来食管癌的研究热点之一。顺铂是食管鳞癌化疗方案中的一种重要化疗药物，其抗肿瘤作用在多年临床应用中已得到了较好的验证，但常规顺铂化疗剂量亦常常会导致消化道不良反应、过敏反应、肾毒性、骨髓抑制、神经毒性、耳毒性，使得顺铂的临床应用受到了一定的影响。如何降低顺铂的不良反应，同时保留其杀伤肿瘤的有效性，成为临床医务工作者和科研人员所关注的重要问题。
芹菜素（Apigenin）是一种广泛存在于水果和蔬菜当中的植物黄酮，食用安全性较好。近年来已有多项研究报道，芹菜素具有抗感染、抗氧化和抗肿瘤等生物学活性[5]。并且，芹菜素已被报道对多种肿瘤如乳腺癌、胃癌、结肠癌、皮肤癌、前列腺癌和血液系统等肿瘤细胞的生长具有抑制作用或引起肿瘤细胞的凋亡[5-11]。但是芹菜素对食管鳞癌顺铂敏感性影响的研究国内外鲜有报道。如果芹菜素可以增强食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性，则有可能在临床中作为一种有效的辅助用药可以减少顺铂的用量，进而减少药物不良反应的发生。因此，本研究使用芹菜素联合顺铂对食管鳞癌TE-1细胞进行干预，采用体外药敏实验和细胞凋亡等实验观察联合芹菜素干预前后食管鳞癌TE-1细胞对顺铂的敏感性改变，初步阐明芹菜素在食管鳞癌细胞对顺铂药物敏感性中的作用和机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、5X蛋白上样缓冲液、丽春红染色液、CCK-8试剂盒和结晶紫（自碧云天生物技术研究所）；RPMI 1640培养基和Hyclone胎牛血清（Hyclone公司）；NC膜和ECL（Millipore）；Hoechst染色试剂盒（碧云天生物技术研究所）；anti-β-actin一抗（sc-47778）和anti-GRP78一抗（sc-166490）（Santa Cruz Biotechnology）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；cisplatin和pigenin（SIGMA-ALDRICH公司）；人食管鳞癌TE-1细胞购自中科院上海细胞库。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 培养TE-1细胞使用添加有10%胎牛血清和加入青霉素/链霉素的RPMI 1640。细胞置于含5% CO2的恒温培养箱内37℃培养。用于实验的细胞均处于对数生长期。
1.2.2 CCK-8生长曲线和药敏实验 使用胰酶消化细胞，培养液重悬，以5×103个/孔（生长曲线实验中为1×103个/孔）接种于96孔板，每孔加培养液200 μL，细胞贴壁16 h后加入适当浓度药物进行体外药物敏感性检测，同时设置调零孔和对照孔，继续孵育72 h（生长曲线实验培养1～7 d）；72 h以后（生长曲线实验则每天取出）取出96孔板，每孔加入CCK-8 20 μL，孵育4 h；酶标仪检测吸光度并分析。①设置5、10、20 μmol/L芹菜素干预组，仅加入同等浓度溶媒DMSO的细胞组作为对照组，观察不同浓度芹菜素对TE-1细胞的生长抑制作用。②设置加入0.000、0.008、0.040、0.200 μg/mL顺铂的4个TE-1细胞组，每组细胞还分为加入0、5、10、20 μmol/L的芹菜素，观察不同浓度芹菜素联合顺铂对TE-1细胞的杀伤作用。
1.2.3 克隆形成实验 使用胰酶消化细胞，培养液重悬，以1×103个/孔的密度接种于24孔板，细胞贴壁16 h后加入适当浓度的药物进行体外药物敏感性检测，每隔3 d更换培养液，共培养14 d；之后，弃培养液，PBS洗3次；甲醇固定10 min，弃固定液，加入含0.5%结晶紫甲醇染色10 min，PBS洗3次；晾干培养板，用数码相机拍照，使用Photoshop CS3软件进行图像分析。设置1个加入0 μg/mL顺铂TE-1细胞组和3个加入0.04 μg/mL顺铂的TE-1细胞组，后3个组分别加入0、5、10 μmol/L的芹菜素，通过克隆形成实验观察芹菜素联合顺铂对TE-1细胞克隆形成的影响。
1.2.4 Hoechst核染色凋亡检测 使用胰酶消化细胞，按1×106个/孔的密度接种于6孔板，细胞贴壁16 h后加入适当浓度药物，置于培养箱中孵育36 h诱导凋亡，弃培养液，固定液固定20 min，弃固定液，PBS洗2次，加0.5 mL Hoechst 33258染色液，避光染色5 min，弃染色液，PBS避光洗2次，抗荧光淬灭液封片，荧光显微镜观察并拍照。凋亡的判断方法：正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色发白。凋亡率的计算方法：随机选择200倍镜下5个视野计算凋亡率，并取平均值。设置1个加入0 μg/mL顺铂TE-1细胞组和3个加入0.2 μg/mL顺铂的TE-1细胞组，后3个组分别加入0、5、10 μmol/L的芹菜素，通过Hoechst 33258核染色实验观察芹菜素对TE-1细胞在顺铂作用下凋亡的影响。
1.2.5 Western blot 使用胰酶消化细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度，加入5X蛋白上样缓冲液加热5 min，SDS-PAGE蛋白电泳，将分离的蛋白湿转至NC膜，丽春红染色，裁剪，PBST洗膜3次，以5%脱脂牛奶PBST封闭1 h，封闭液稀释适当浓度的一抗后与条带在4℃过夜，PBST洗膜3次，用封闭液稀释适当浓度的二抗与条带室温下孵育1 h；PBST洗膜4次，加ECL溶液，暗室显影观察。设置3个加入0.2 μg/mL顺铂的TE-1细胞组，分别加入0、5、10 μmol/L的芹菜素，通过Western blot实验检测芹菜素对顺铂作用下TE-1细胞中GRP78蛋白表达的影响。
1.3 统计学方法
使用SPSS 17.0统计软件进行实验数据分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 芹菜素对TE-1细胞的抑制作用
CCK-8实验结果提示，芹菜素对TE-1细胞具有生长抑制的作用，且有明显的浓度依赖性。见表1。
2.2 不同浓度芹菜素联合顺铂对TE-1细胞的杀伤作用
使用不同浓度芹菜素联合低浓度顺铂共同作用于TE-1细胞以后，CCK-8药敏实验结果提示，与单用顺铂比较，芹菜素可以显著增加食管鳞癌TE-1细胞对顺铂的药物敏感性（P < 0.05），且这一作用随芹菜素浓度增加而增强，有浓度依赖性。见表2。
2.3 芹菜素联合顺铂可显著减少TE-1细胞的克隆形成
不同浓度芹菜素和顺铂作用于TE-1细胞后，平板克隆实验结果提示，与仅加入顺铂组克隆形成率（82.83%）比较，加入5 μmol/L的芹菜素以后，TE-1细胞克隆形成率明显减少（44.30%）；进一步提高芹菜素浓度（10 μmol/L）后，TE-1细胞克隆形成率出现进一步下降（29.77%），差异有统计学意义（P < 0.05），提示芹菜素可以增强顺铂对TE-1细胞的杀伤作用。
2.4 芹菜素可明显增加TE-1细胞在顺铂作用下的凋亡
Hoechst 33258核染色结果显示，与不加药对照组和仅加顺铂组相比，在芹菜素联合顺铂作用于TE-1细胞后核浓染和碎裂的细胞显著增多（图1），且当加入的芹菜素浓度逐步增加后，发生凋亡和坏死的细胞数目均进一步增多，差异有高度统计学意义（P < 0.01）（图2），提示芹菜素促进了顺铂诱发的TE-1细胞凋亡。
2.5 芹菜素可在联合顺铂作用下使TE-1细胞GRP78的表达减少
Western blot 检测结果提示，与单用顺铂组比较，TE-1细胞在联合芹菜素作用后GRP78蛋白的表达显著减少，且这一作用随芹菜素浓度升高更加明显。见图3。
3 讨论
近年来，芹菜素作为天然存在于水果和蔬菜的一种植物黄酮，因其具有较强的抗炎、抗氧化和抗肿瘤等生物活性，受到了越来越多的关注。在抗肿瘤方面，目前研究发现芹菜素可以通过多种途径抑制肿瘤的生长和促进凋亡的发生[5]，提示其在抗肿瘤的临床治疗中具有较好的应用前景。芹菜素曾被报道可以通过G2/M细胞周期阻滞和诱导凋亡而对食管鳞癌KYSE-510细胞产生细胞毒性作用，具体机制与上调p21和PIG3及下调cyclin B1有关[12]。但是，芹菜素对食管鳞癌细胞化疗药物敏感性和应激抵抗的影响尚不清楚，芹菜素与顺铂联合在食管鳞癌治疗方面的研究也鲜有报道。
在本研究中，首先检测了芹菜素对TE-1细胞的抑制作用，初步确定了芹菜素单独作用抑制细胞生长的能力；然后，在顺铂联合不同浓度的芹菜素干预下，发现芹菜素有助于提高顺铂对TE-1细胞的杀伤性，且这一作用随芹菜素浓度增加而增强；进一步的凋亡检测结果提示，联合芹菜素可以增加顺铂导致的TE-1细胞凋亡；最后，在Western blot检测中还发现，芹菜素联合顺铂作用于TE-1细胞后GRP78的表达明显减少，提示抵抗应激能力的减弱可能也是芹菜素联合顺铂对TE-1细胞杀伤作用增强的机制之一。
GRP78是非折叠蛋白反应中一种重要的应激保护蛋白，也是膜蛋白和分泌蛋白正确折叠和组装的一种重要的内质网分子伴侣[13-15]。诸如缺氧、营养物质缺乏和毒性物质导致的多种应激均可引起GRP78的表达增加，多个研究发现过表达的GRP78存在于多种恶性肿瘤中，并可以导致肿瘤细胞对应激抵抗能力和化疗药物耐药性的增强以及促进侵袭和转移的发生[13，16-20]。在本研究中发现小剂量芹菜素在联合较低浓度顺铂的作用下可以明显增强其抗肿瘤作用，并且这一作用与促进凋亡和引起应激保护蛋白GRP78的表达减少有关，提示芹菜素很可能通过影响食管鳞癌细胞抗凋亡和对应激抵抗的能力，进而导致其对顺铂敏感性发生改变。然而，引起这些作用的具体信号途径还有待进一步研究进行阐明。
综上所述，芹菜素可以有效增强食管鳞癌TE-1细胞对顺铂的药物敏感性，其机制与促进化疗药物作用下的凋亡和降低肿瘤细胞的应激抵抗能力有关。因此，联合芹菜素有可能降低顺铂在食管鳞癌化疗中的用量，从而兼具良好的肿瘤杀伤效应和减少其药物不良反应。本研究结果进一步阐明了芹菜素在抗肿瘤治疗中的作用和机制，为今后临床中食管鳞癌化疗用药方案的优化提供了新的理论依据。
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（收稿日期：2015-08-10 本文编辑：苏 畅）